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在機(jī)體內(nèi)部隨時(shí)都在發(fā)生著細(xì)胞的死亡。傳統(tǒng)上用顯微鏡來觀察細(xì)胞的死亡，其特征為核染色質(zhì)的濃縮及碎片的形成。但是這種現(xiàn)象出現(xiàn)的很晚，時(shí)間也很短暫。凋亡的特征是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細(xì)胞自身的染色質(zhì)或DNA 被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與DNA斷點(diǎn)數(shù)目相同的3’-OH 末端。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)可以將地高辛標(biāo)記的dUTP(DIG-dUTP)標(biāo)記至3’-OH 末端，DIG-dUTP 結(jié)合在DNA斷點(diǎn)部位，可以通過生物素化抗地高辛抗體(Anti-DIG-Biotin)和 SABC-AP反應(yīng)后，加入顯色底物 BCIP/NBT予以顯示。凋亡的細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細(xì)胞。

試劑盒內(nèi)容：

1.標(biāo)記緩沖液(Labeling Buffer)1ml

2.末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT,×20)20μl

3.DIG-dUTP(×20)20μl

4.封閉液(Blocking Reagent)4ml

5.生物素化抗地高辛抗體(×100)20μl

6..SABC-AP(×100)20μl

7.Proteinase K(×200)50μl

8.BCIP/NBT 顯色劑(×20)0.2ml

9.抗體稀釋液4ml

陽性對(duì)照片2張

用戶自備試劑：

1.多聚賴氨酸或APES。

2.0．01M TBS(pH7.5)(配法:1L 雙蒸餾水中加入8.5克氯化鈉,1.2 克Tris和0.45—0.5ml純乙酸)。

3.0.01M TBS(pH9.0--9.5)(配法:1L 雙蒸餾水中加入 8.5克氯化鈉,1.2克Tris)。

4.核固紅—復(fù)染用。

5.水溶性封片劑。

操作步驟：

1.樣品處理

(1)玻片預(yù)先用多聚賴氨酸或APES進(jìn)行處理。

(2)細(xì)胞涂片和冰凍切片：最重要的是及時(shí)固定。用 4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0---7.6)室溫下固定 30—60分鐘。PBS洗2分鐘×2次。蒸餾水洗滌 2分鐘×2次。

(3)組織：應(yīng)及時(shí)固定。常規(guī) 4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0---7.6)或10%中性緩沖福爾馬林固定 4 小時(shí)以上，石蠟包埋。切片常規(guī)脫蠟入水(脫蠟務(wù)必干凈)。

2.標(biāo)本片加 0．01M TBS(pH7.5)1：200 新鮮稀釋 Proteinase K 37℃消化 1—15分鐘,TBS洗2分鐘×3次。(細(xì)胞涂片和冰凍切片一般不消化或僅消化 10—60 秒鐘。新鮮石蠟切片消化 5-10分鐘。陳舊石蠟切片消化 10-15分鐘)。

3.標(biāo)本片加標(biāo)記緩沖液(Labeling Buffer),20μl/片,以保持切片濕潤(rùn)。然后按每張切片取 TdT和 DIG-d-UTP 各1μl，加入18μl標(biāo)記緩沖液中，混勻，甩去切片上多余液體后加混合的標(biāo)記液，20μl/片。置樣品于濕盒中，37℃標(biāo)記2 小時(shí)。

4.0．01M TBS(pH7.5)洗2分鐘×3次。

5.加封閉液 50μl/片，室溫 30分鐘，甩掉封閉液，不洗。

6.用抗體稀釋液 1：100 稀釋生物素化抗地高辛抗體：(取1ml抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體 10μl)，混勻后 50μl/片加至標(biāo)本片上。置樣品于濕盒中，37℃反應(yīng) 30-60分鐘。0.01M TBS(pH7.5)洗2分鐘×3次。

7.用抗體稀釋液 1：100 稀釋 SABC-AP：取1ml抗體稀釋液加 SABC-AP 10μl，混勻后50μl/片加至切片。37℃反應(yīng) 60分鐘。0.01M TBS(pH7.5)洗5分鐘×4次。

8.BCIP/NBT 顯色：BCIP/NBT(×20)按 1：20的比例用 0.01M TBS(pH9.0-9.5)稀釋，混勻。顯色液加至標(biāo)本上。避光顯色 20-30分鐘，若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。充分水洗。

9.必要時(shí)可用核固紅等復(fù)染。水溶性封片劑封片，也可簡(jiǎn)單地用甘油封片。

鏡檢。

結(jié)果判定：

細(xì)胞核中有紫藍(lán)色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡的細(xì)胞。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Ⅱ(AP) 細(xì)胞生物學(xué)研究有以下幾個(gè)方面。

細(xì)胞生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容十分廣泛,主要包括。
①細(xì)胞核、染色體以及基因表達(dá)的研究。
②生物膜與細(xì)胞器的研究。
③細(xì)胞骨架體系的研究。
④細(xì)胞增殖及其調(diào)控。
⑤細(xì)胞分化及其調(diào)控。
⑥細(xì)胞的衰老與編程性死亡(凋亡)。
⑦細(xì)胞的起源與進(jìn)化。
⑧細(xì)胞工程。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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