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Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用紅色熒光染料PE（Phycoerythrin）標(biāo)記的Annexin V作為探針，來(lái)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生，可用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或其他熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

其檢測(cè)原理為：在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合?？赏ㄟ^(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。

另外，本試劑盒中提供的7-AAD可用來(lái)區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。7-AAD是一種核酸染料，同PI有著相似的熒光特性，但其發(fā)射光譜較PI窄，對(duì)其他檢測(cè)通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的最佳替代品，可與Annexin V聯(lián)合使用。該染料不能透過(guò)正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可穿透晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞并與其內(nèi)的DNA結(jié)合。因此將Annexin V-PE與7-AAD聯(lián)合使用時(shí)，7-AAD則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/7-AAD-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/7-AAD-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被Annexin V-PE和7-AAD結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽(yáng)性（Annexin V+/7-AAD+）。

試劑盒組份：

重組人Annexin V/PE（rh Annexin V/PE）—————100µl

7-AAD Viability Staining Solution（20µg/ml）——200µl

4×Binding Buffer————————————————4ml

注意事項(xiàng)

1) 試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

2) 由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速的過(guò)程，建議樣品在染色后1小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行分析。

3) 對(duì)于貼壁細(xì)胞，消化是一個(gè)關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。處理貼壁細(xì)胞時(shí)要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。胰酶消化時(shí)間過(guò)短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，7-AAD攝入過(guò)多；消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-PE的結(jié)合。消化時(shí)將胰酶鋪滿(mǎn)孔板底后，輕搖時(shí)胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時(shí)間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會(huì)影響Annexin V與PS的結(jié)合。

4) 如果樣品來(lái)源于血液，請(qǐng)務(wù)必除去血液中的血小板。因?yàn)檠“搴蠵S，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？梢允褂煤蠩DTA的緩沖劑并低速離心（200×g）洗去血小板，然后用Annexin V結(jié)合緩沖液清洗細(xì)胞，以避免殘留的EDTA會(huì)螯合Ca2+。

5) 7-AAD為潛在致癌物，操作時(shí)請(qǐng)采取防護(hù)措施，穿防護(hù)服、戴手套等。

6) Annexin V-PE和7-AAD是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)請(qǐng)注意避光。

儲(chǔ)存條件：4℃，有效期一年。

Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒細(xì)胞生物學(xué)研究有以下幾個(gè)方面。

細(xì)胞生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容十分廣泛,主要包括。
①細(xì)胞核、染色體以及基因表達(dá)的研究。
②生物膜與細(xì)胞器的研究。
③細(xì)胞骨架體系的研究。
④細(xì)胞增殖及其調(diào)控。
⑤細(xì)胞分化及其調(diào)控。
⑥細(xì)胞的衰老與編程性死亡(凋亡)。
⑦細(xì)胞的起源與進(jìn)化。
⑧細(xì)胞工程。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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