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在機體內(nèi)部隨時都在發(fā)生著細胞的死亡。傳統(tǒng)上用顯微鏡來觀察細胞的死亡，其特征為核染色質(zhì)的濃縮及碎片的形成。但是這種現(xiàn)象出現(xiàn)的很晚，時間也很短暫。凋亡的特征是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細胞自身的染色質(zhì)或DNA 被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與 DNA 斷點數(shù)目相同的3’-OH 末端。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase)可以將地高辛標記的dUTP(DIG-dUTP)標記至 3’-OH 末端，DIG-dUTP 結合在 DNA 斷點部位，可以通過生物標記的抗地高辛抗體(Anti-DIG-Biotin)反應后，再結合鏈酶親和素-熒光素 FITC(SABC-FITC)。FITC 在 490-495nm 激化，在 520-530nm 發(fā)射熒光，呈黃綠色。凋亡的細包核呈黃綠色，從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細胞。

試劑盒內(nèi)容：

1．標記緩沖液(Labeling Buffer)1ml

2．末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT,×20)20μl

3．DIG-dUTP(×20)20μl

4．封閉液(Blocking Reagent)4ml

5．生物素化抗地高辛抗體(× 100)20μl

6．SABC-FITC(× 100)20μl

7．Proteinase K(×200)50μl

8．抗體稀釋液 4ml

陽性對照片2張

用戶自備試劑：

1．多聚賴氨酸或APES。

2．0.01M TBS,PH7.5(配法:1L 雙蒸餾水中加入 8.5 克氯化鈉,1.2 克 Tris和 0.45—0.5ml 純乙酸。)

3．DAPI 染色液

4．水溶性封片劑或抗熒光衰減封片劑。

操作步驟：

1．樣品處理

(1)玻片預先用多聚賴氨酸或APES 進行處理。

(2)細胞涂片和冰凍切片：最重要的是及時固定。用 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)室溫下固定 30—60分鐘。0.01M PBS洗2分鐘×2次。蒸餾水洗滌 2分鐘×2次。

(3)組織：有條件時應及時固定。常規(guī) 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性緩沖福爾馬林固定 4 小時以上，石蠟包埋。切片常規(guī)脫蠟入水(脫蠟務必干凈)。

2．標本片加 0.01M TBS 1:200 新鮮稀釋 Proteinase K 37℃消化 1—15分鐘,0.01M TBS洗2分鐘×3次。(細胞涂片和冰凍切片一般不消化或消化 10—60秒鐘。新鮮石蠟切片消化 5-10分鐘。陳舊石蠟切片消化 10-15分鐘)。

3．標本片加標記緩沖液(Labeling Buffer)20μl/片,以保持切片濕潤。按每張切片取 TdT和 DIG-d-UTP 各 1μl，加入 18μl標記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加標記液，20μl/片。置樣品于濕盒中，37℃標記2 小時。

4．0.01M TBS洗2分鐘×3次。

5．加封閉液 50μl/片，室溫 30分鐘，甩掉封閉液，不洗。

6．用抗體稀釋液 1：100 稀釋生物素化抗地高辛抗體：(取1ml抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體10μl)，混勻后 50μl/片加至標本片上。置樣品于濕盒中，37℃反應30分鐘。

0.01M TBS洗2分鐘×3次。

7．用抗體稀釋液 1：100 稀釋 SABC：取 1ml 抗體稀釋液加 SABC 10μl，混勻后 50μl/片加至切片。37℃反應 30分鐘。0.01M TBS洗5分鐘×4次。

8．必要時可用DAPI染色液輕度復染，蒸餾水洗。抗熒光衰減封片劑封片(可用甘油代替)。熒光顯微鏡觀察。

結果判定：

細胞核中有黃綠色顆粒者為陽性細胞，即凋亡的細胞。

注意事項：

1．試劑盒嚴格-20℃存放。

2．初用時如試管底部無可見的試劑，在離心機離心5分鐘，使試劑沉至管底。

3．檢測過程中切勿使樣品干涸。

試劑盒 細胞生物學研究有以下幾個方面。

細胞生物學的研究內(nèi)容十分廣泛,主要包括。
①細胞核、染色體以及基因表達的研究。
②生物膜與細胞器的研究。
③細胞骨架體系的研究。
④細胞增殖及其調(diào)控。
⑤細胞分化及其調(diào)控。
⑥細胞的衰老與編程性死亡(凋亡)。
⑦細胞的起源與進化。
⑧細胞工程。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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