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本試劑盒也稱乳酸脫氫酶檢測試劑盒(LDH Assay Kit)或乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒(LDH Release Assay Kit)，是一種基于diaphorase催化的INT顯色反應(yīng)，通過比色法檢測細(xì)胞毒性時釋放的乳酸脫氫酶活性或檢測其它樣品中的乳酸脫氫酶活性的試劑盒。
本試劑盒可以用于常規(guī)的乳酸脫氫酶活性的檢測，更常用于以LDH釋放為指標(biāo)的細(xì)胞毒性檢測。同時，基于細(xì)胞總?cè)樗崦摎涿富钚缘臋z測，本試劑盒也可以用于檢測細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測。
細(xì)胞凋亡或壞死而造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液里，其中包括酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)。通過檢測從質(zhì)膜破裂的細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH的活性，就可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞毒性的定量分析。LDH釋放被看做細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，并被廣泛用于細(xì)胞毒性檢測。LDH釋放被認(rèn)為是以前使用放射性的51Cr標(biāo)記細(xì)胞，隨后通過51Cr釋放進(jìn)行細(xì)胞膜完整性檢測的安全有效的替代方法。
本試劑盒的基本原理是，在乳酸脫氫酶的作用下，NAD+被還原生成NADH，NADH和INT(2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)催化反應(yīng)生成NAD+和強(qiáng)生色物甲臜(formazan)，在490nm波長下產(chǎn)生吸收峰，從而可以通過比色來定量乳酸脫氫酶的活性。吸光度與乳酸脫氫酶活性成線性正相關(guān)。該酶聯(lián)反應(yīng)原理的示意圖如下：

試劑盒組份（100次為例）：
LDH釋放試劑——————1.5ml
乳酸溶液———————2ml
酶溶液————————1ml×2
INT溶液(10X)—————0.2ml
INT稀釋液——————2ml
注意事項(xiàng)：
1.冷凍會使樣品中部分乳酸脫氫酶失活，4℃可放置2-3天。建議樣品準(zhǔn)備好后盡量當(dāng)天完成測定。
2.如果檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶，由于血清含有乳酸脫氫酶，建議血清的使用濃度不要超過1%，并最好使用熱滅活血清。如果一定需要使用10%血清，在檢測時一定要設(shè)置沒有細(xì)胞，但加入了相同體積培養(yǎng)液的對照孔，以用于消除背景。
3.細(xì)胞過度生長、密度過高、離心速度過大、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過大，都會造成細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶增加。
4.如果希望進(jìn)行乳酸脫氫酶活性的絕對定量，用戶需自備乳酸脫氫酶標(biāo)準(zhǔn)品。
儲存條件：-20℃，有效期一年。
使用方法：
一、樣品的準(zhǔn)備：
方法一：LDH釋放檢測
a.根據(jù)細(xì)胞的大小和生長速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使待檢測時細(xì)胞密度不超過80-90%滿。
b.吸去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌一次。換新鮮培養(yǎng)液(推薦使用含1%血清的低血清培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)臒o血清培養(yǎng)液)，將各培養(yǎng)孔分成如下幾組：包括無細(xì)胞的培養(yǎng)液孔(背景空白對照孔)，未經(jīng)藥物處理的對照細(xì)胞孔(樣品對照孔)，未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔(樣品最大酶活性對照孔)，以及藥物處理的細(xì)胞孔(藥物處理樣品孔)，并做好標(biāo)記。按照實(shí)驗(yàn)需要給予適當(dāng)藥物處理(如加入0-10μl左右特定的藥物刺激，可設(shè)置不同濃度，不同處理時間，對照孔中需加入適當(dāng)?shù)乃幬锶軇φ?，繼續(xù)按常規(guī)培養(yǎng)。到預(yù)定的檢測時間點(diǎn)前1小時，從細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在“樣品最大酶活性對照孔”中加入試劑盒提供的LDH釋放試劑，加入量為原有培養(yǎng)液體積的10%。加入LDH釋放試劑后，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。
c.到達(dá)預(yù)定時間后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測定。
方法二：細(xì)胞內(nèi)總LDH的檢測
a.細(xì)胞毒性檢測：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使待檢測時細(xì)胞密度不超過80-90%滿。加入不同藥物進(jìn)行處理，并設(shè)置適當(dāng)對照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl 用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻)，適當(dāng)搖晃培養(yǎng)板混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測定。
b.細(xì)胞增殖檢測：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使促進(jìn)細(xì)胞增殖的藥物刺激后細(xì)胞不超過80-90%滿為宜。使用不同的藥物刺激細(xì)胞，并設(shè)置適當(dāng)對照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl 用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻)，適當(dāng)搖晃混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測定。

細(xì)胞毒性檢測試劑盒(乳酸脫氫酶法)細(xì)胞生物學(xué)研究有以下幾個方面。

細(xì)胞生物學(xué)的研究內(nèi)容十分廣泛,主要包括。
①細(xì)胞核、染色體以及基因表達(dá)的研究。
②生物膜與細(xì)胞器的研究。
③細(xì)胞骨架體系的研究。
④細(xì)胞增殖及其調(diào)控。
⑤細(xì)胞分化及其調(diào)控。
⑥細(xì)胞的衰老與編程性死亡(凋亡)。
⑦細(xì)胞的起源與進(jìn)化。
⑧細(xì)胞工程。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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