產(chǎn)品目錄

中文名稱：MTT檢測(cè)試劑盒
英文名稱：MTT Assay Kit
產(chǎn)品規(guī)格：500次
發(fā)貨周期：1～3天
MTT廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)，其原理是MTT可以被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成深紫色的formazan結(jié)晶，而死細(xì)胞則無(wú)此活性。深紫色的formazan結(jié)晶被溶解后可以通過(guò)測(cè)定490nm波長(zhǎng)的光吸收而測(cè)定出其濃度，并由此推測(cè)出細(xì)胞的活力，細(xì)胞增殖越旺盛，則吸光度越高；細(xì)胞毒性越大，則吸光度越低。其原理如下：

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1．采用獨(dú)特的Formazan溶解液，可以充分溶解formazan，減少誤差。

2．背景低，靈敏度高，線性范圍寬，重復(fù)性好。

3．本產(chǎn)品為足夠500次(5個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)微孔板檢測(cè)。

4．可用于生物活性因子活性檢測(cè)、抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性測(cè)定等。

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸、-20℃保存(但溶液B也可以常溫運(yùn)輸和保存)，有效期一年。

使用方法：

下面操作是檢測(cè)細(xì)胞毒性的試驗(yàn)，其他應(yīng)用跟此類似或更簡(jiǎn)單(如生長(zhǎng)曲線試驗(yàn))，操作步驟可以以此為基礎(chǔ)稍作修改即可，故不再贅述。

㈠、接種細(xì)胞

1．按常規(guī)胰酶消化法消化匯合的單層細(xì)胞，收集到含血清的培養(yǎng)基中。

2．200g離心5分鐘收集細(xì)胞沉淀。

3．用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，制備成單細(xì)胞懸浮液并計(jì)數(shù)。

4．將細(xì)胞稀釋到2.5×103個(gè)/mL～5×10個(gè)/mL之間(需要根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度決定)，如果不知道生長(zhǎng)數(shù)度，一般可以稀釋到1×10個(gè)/mL。

5．將足夠量的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中(便于用排槍取樣)。一個(gè)96孔板的MTT檢測(cè)需要約20mL的細(xì)胞懸液。

6．用排槍在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL細(xì)胞懸液(對(duì)正常細(xì)胞)。如果是腫瘤細(xì)胞，則加入100μL腫瘤細(xì)胞懸液和100μL培養(yǎng)基(總體積為200μL)。注意：一定要把細(xì)胞加在孔的正中，否則細(xì)胞會(huì)聚集在孔的角落處，影響試驗(yàn)。

7．用排槍在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟細(xì)胞懸液等體積的培養(yǎng)基。第1 列各孔將作為+培養(yǎng)基-細(xì)胞+MTT對(duì)照(用于測(cè)OD時(shí)調(diào)零)，第12列加培養(yǎng)基的作用是減少邊緣效應(yīng)對(duì)第11 列反應(yīng)的影響。

8．按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法在37℃和5% CO2條件下孵育1-3天，使細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期。

㈡、藥物處理

9．用培養(yǎng)基將藥物稀釋到8個(gè)待測(cè)濃度(如果不知道待測(cè)濃度，則需要預(yù)試驗(yàn)確定)，一般一種藥物需要做3塊平行板。

10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培養(yǎng)基(不要觸動(dòng)細(xì)胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培養(yǎng)基。

11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鮮培養(yǎng)基，這些孔將作為+培養(yǎng)基+細(xì)胞-藥物的對(duì)照。

12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8個(gè)濃度梯度的待測(cè)藥物，每列加入一個(gè)濃度的藥物。

13．按常規(guī)方法把96孔板繼續(xù)放在在37℃和5% CO2條件下孵育一定的時(shí)間，此段時(shí)間即為藥物處理細(xì)胞的時(shí)間，由用戶自己決定。

14．處理結(jié)束后去除第2 到第11列(共10列，均含細(xì)胞)所有孔中的培養(yǎng)基，并再加入100μL新鮮培養(yǎng)基。

15．每天換培養(yǎng)使細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增2-3倍(所需時(shí)間隨細(xì)胞不同而不同)。

㈢、存活細(xì)胞計(jì)數(shù)

16．在生長(zhǎng)末期，去除第1到第11列各孔中的培養(yǎng)基后，再加入100μL新鮮培養(yǎng)基和10μL溶液A(含MTT成分)，用錫箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-8小時(shí)。注意：溶液A在低溫情況下會(huì)凝固，使用前請(qǐng)室溫放置或20-25℃水浴至全部溶解，搖勻后使用。MTT有致癌性，一定要帶手套操作。

17．小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基(含溶液A)。由于培養(yǎng)基可能會(huì)影響光吸收，最好盡可能去除。

18．每孔加入100μL溶液B，置搖床上低速振蕩10分鐘，使MTT形成的formazan結(jié)晶物充分溶解。

19．由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，故需要立即在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇490nm測(cè)定吸光度。

注意：用第1 列各孔(+培養(yǎng)基-細(xì)胞+MTT對(duì)照)調(diào)零。

20．計(jì)數(shù)同樣處理的各次重復(fù)的平均值。

21．以藥物濃度為橫軸，以吸光度為縱軸繪制曲線。由于各處理吸光度絕對(duì)值差別很大，一般需將其轉(zhuǎn)化成生長(zhǎng)抑制率(以不加藥物的第2和第11列各孔數(shù)據(jù)的平均數(shù)作為100%)，這樣便于計(jì)算出IC50，用于各種藥物處理效果的比較。注意：如果測(cè)生長(zhǎng)曲線，則以時(shí)間為橫軸。正常生長(zhǎng)曲線一般呈現(xiàn)S型，具有促進(jìn)作用的則斜率加大。

MTT檢測(cè)試劑盒細(xì)胞生物學(xué)研究有以下幾個(gè)方面。

細(xì)胞生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容十分廣泛,主要包括。
①細(xì)胞核、染色體以及基因表達(dá)的研究。
②生物膜與細(xì)胞器的研究。
③細(xì)胞骨架體系的研究。
④細(xì)胞增殖及其調(diào)控。
⑤細(xì)胞分化及其調(diào)控。
⑥細(xì)胞的衰老與編程性死亡(凋亡)。
⑦細(xì)胞的起源與進(jìn)化。
⑧細(xì)胞工程。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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