人胚肺二倍體細(xì)胞衰老特征變化

閱讀：556     發(fā)布時間：2019/12/26 13:36:47

         細(xì)胞衰老是隨著時間的推移,細(xì)胞增殖能力和生理功能逐漸下降的變化過程,是個體衰老的重要基礎(chǔ)。體外培養(yǎng)二倍體細(xì)胞是目前用于疫苗生產(chǎn)最安全的細(xì)胞基質(zhì),其使用代次限制在生命周期的三分之二以內(nèi)。目前對不同代次二倍體細(xì)胞在細(xì)胞、蛋白及分子等不同層次的變化尚不清楚,缺乏評價二倍體細(xì)胞衰老程度的有效手段。研究人胚肺二倍體細(xì)胞衰老特征變化,對生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)安全評價以及衰老相關(guān)疾病研究具有重要意義。

         方法：1.將Walvax-2細(xì)胞分20代、25代、30代、35代至45代、50代和55代共16個代次,其中35代到45代之間均隔1代；2倒置顯微鏡下觀察不同代次Walvax-2細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)及生長情況；3.透射電鏡下觀察不同代次Walvax-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；4.以細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色法檢測不同代次Walvax-2細(xì)胞β-半乳糖苷酶表達(dá)；5.以TRAP-PCR方法檢測不同代次Walvax-2細(xì)胞端粒酶活性；6.繪制作生長曲線,觀察不同代次Walvax-2細(xì)胞生長增殖能力；7.通過流式細(xì)胞儀檢測不同代次Walvax-2細(xì)胞周期時相和細(xì)胞凋亡；8.Western印跡法檢測不同代次Walvax-2細(xì)胞的P16基因和BMI-1基因的蛋白表達(dá)。
        結(jié)果：1.倒置顯微鏡下：P20到P45生長狀態(tài)良好且生長迅速,細(xì)胞為典型長梭狀,為致密單層,緊密排列,呈編織狀走行。胞內(nèi)顆粒少,無空泡,膜清晰,符合二倍體成纖維細(xì)胞特性。P50細(xì)胞排列不規(guī)則,形狀偏扁,體積縮小、顏色加深,邊界不清,形態(tài)不規(guī)則,鏡下可見少許圓縮細(xì)胞。P55貼壁生長的細(xì)胞散亂,細(xì)胞間空隙多,距離遠(yuǎn),細(xì)胞間的接觸消失,細(xì)胞圓縮數(shù)大量增加, 細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清楚,成批的細(xì)胞出現(xiàn)脫落,離壁飄起的現(xiàn)象。細(xì)胞可傳58代,隨細(xì)胞代次的增加,可見顏色逐漸加深,色素積累。2.透射電子顯微鏡觀察到：P20到P43細(xì)胞體積均正常且骨架結(jié)構(gòu)明顯,細(xì)胞膜微絨毛均勻分布,核糖體豐富,細(xì)胞核完整,核膜光滑,具有較高的核質(zhì)比。P44開始出現(xiàn)衰老現(xiàn)象,凋亡小體出現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔膨脹擴(kuò)大,核糖體數(shù)量減少,細(xì)胞質(zhì)色素積聚加深,有空泡形成,細(xì)胞中出現(xiàn)自噬體,細(xì)胞核形狀不規(guī)則,核膜不同程度內(nèi)折,核仁變小,內(nèi)容物增多。P50和P55細(xì)胞衰老更加明顯,大量細(xì)胞變形,體積增大,細(xì)胞膜完整性遭到破壞,細(xì)胞質(zhì)色素積聚加深,微絲和微管崩解,可見大量空泡形成,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體崩解；自噬體數(shù)量增加,細(xì)胞核模糊不清。3.β-半乳糖苷酶檢測顯示：與初始代次年輕細(xì)胞P20(陽性細(xì)胞率13.42%)相比,衰老代次P55的陽性細(xì)胞率(37.72%)增強(qiáng),Walvax-2人胚肺二倍體細(xì)胞趨向老化過程中β-半乳糖苷酶的陽性染色率逐代遞增。β-半乳糖苷酶的陽性染色率和細(xì)胞代齡之間呈顯著相關(guān)(P0.05)。4.端粒酶的檢測結(jié)果分析顯示：P20至P55端粒酶活性呈整體減少趨勢,Walvax-2細(xì)胞端粒酶活性與代齡無顯著性相關(guān)(P0.05)。5生長曲線分析顯示：P50相比P20的生長速度明顯減慢,P20的細(xì)胞活力明顯強(qiáng)于P40(P0.05)和P50(P0.05),P30的細(xì)胞活力明顯強(qiáng)于P40(P0.05)和P50(P0.05),P40的細(xì)胞活力明顯強(qiáng)于P50(P0.05)。6流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：不同代次G0/G1期百分比無變化,G2/M期同S期百分比隨細(xì)胞代齡增長而降低,P55的S期細(xì)胞基本消失。檢測到的細(xì)胞碎片隨細(xì)胞代齡增長而增加,P55的細(xì)胞碎片達(dá)到36.83%。S期所占百分比與細(xì)胞代齡間的增長顯著負(fù)相關(guān)(P0.05),G2/M期所占百分比與細(xì)胞代齡間的增長顯著負(fù)相關(guān)(P0.05),細(xì)胞碎片所占百分比與細(xì)胞代齡間的增長顯著正相關(guān)(P0.05)。7. Western印跡法檢測結(jié)果顯示：不同代次Walvax-2細(xì)胞的p16蛋白和BMI-1蛋白均未檢測到表達(dá)。
          結(jié)論：1、細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,β-半乳糖苷酶染色陽性率,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期中的S期、G2/M期和細(xì)胞碎片,細(xì)胞生長曲線均與Walvax-2細(xì)胞代齡增長顯著相關(guān)?？蛇x擇作為Walvax-2細(xì)胞衰老程度評價的生物學(xué)指標(biāo)。2、端粒酶活性與Walvax-2細(xì)胞代齡間的增長整體呈負(fù)相關(guān)趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義。是否適合作為Walvax-2細(xì)胞衰老評價生物學(xué)指標(biāo)有待進(jìn)一步研究。3、Walvax-2細(xì)胞中p16蛋白和BMI-1蛋白均未檢測到表達(dá),不適合作為Walvax-2細(xì)胞衰老評價生物學(xué)指標(biāo)。
          以人胚肺二倍體細(xì)胞Walvax-2細(xì)胞為研究對象,在細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)、酶學(xué)變化、蛋白表達(dá)以及細(xì)胞生長等不同水平,通過檢測不同代次人胚肺二倍體細(xì)胞衰老相關(guān)標(biāo)記物,篩選出能夠評價人胚肺二倍體細(xì)胞衰老程度的可靠生物學(xué)指標(biāo)。