產(chǎn)品目錄

生物醫(yī)學實驗中，常常需要從液體樣品(如血漿，培養(yǎng)基)中純化病毒，但由于病毒顆粒十分細小，傳統(tǒng)的分離方法是使用長時間超速離心才能將其從液體樣品中分離出來，此操作非常繁瑣，并且病毒在此過程中容易變性。為了克服傳統(tǒng)方法的缺點，本公司開發(fā)了本產(chǎn)品。

產(chǎn)品特點

能濃縮病毒100倍以上，適合各種病毒。

比超速離心法、密度梯度離心分離法和過濾法更溫和，回收率更高，并且大部分病毒能保持活性，適合各種后續(xù)實驗，包括轉染實驗和核酸純化。

比超速離心法和密度梯度離心分離法簡單，不需要大型離心機等設備。

適合水樣、細胞培養(yǎng)基上清和其他不含細胞的樣品。本產(chǎn)品100mL可以處理400mL含病毒的溶液，可以將病毒濃縮100倍以上。

已經(jīng)成功用于coronaviruses、rhabdoviruses、parainfluenzaviruses、respiratory syncytial virus、rubella virus、picornaviruses等病毒。

對環(huán)境水樣，請不要使用本產(chǎn)品，而是使用水體病毒沉淀劑。

儲存條件：常溫運輸和保存，有效期一年。

自備試劑

PBS緩沖液或TES緩沖液(用于重懸病毒)

使用方法

注意：需要盡量減少含病毒溶液中蛋白的濃度。收集培養(yǎng)細胞分泌的病毒前，最好換上不含血清蛋白和其他蛋白成分的培養(yǎng)基。

將培養(yǎng)細胞刮下，和培養(yǎng)基一起全部轉移到干凈的離心管中，10000rpm 4℃離心20分鐘。轉移上清(含病毒)到新離心管中。如果培養(yǎng)細胞內還有病毒顆粒，并且病毒顆?？梢缘挚箖鋈冢瑒t可以把細胞凍融數(shù)次，釋放出包漿的病毒，然后再轉移到干凈的離心管中，10000rpm 4℃離心20分鐘。轉移上清(含病毒)到新離心管中。如果病毒溶液不含細胞成分，則直接進入下一步。

在含病毒的上清中加入1/4總體積的本產(chǎn)品(4mL病毒溶液則加1mL本產(chǎn)品)，4℃冰箱中放置過夜或12小時以上。病毒在此期間將形成沉淀。

10000rpm 4℃離心20分鐘收集病毒沉淀，盡可能棄掉所有上清(可以暫時保留上清，等確認病毒濃縮成功后再丟棄)。

將離心管放回離心機短暫離心數(shù)秒，再次小心去除殘留上清。

將沉淀(病毒顆粒)溶于適量預冷的自備的緩沖液(如PBS緩沖液、TES緩沖液和培養(yǎng)基中，取決于后續(xù)實驗)，立即使用或者-20℃長期保存。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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