抗體的酶標(biāo)記方法及標(biāo)記效果測定

閱讀：331     發(fā)布時間：2023/4/21 11:40:41

 抗體的酶標(biāo)記方法及標(biāo)記效果測定

 

1.標(biāo)記方法 良好的酶結(jié)合物取決于兩個條件:即高效價的抗體和高活性的酶?？贵w的活性和純度對制備標(biāo)記抗體至關(guān)重要，因為特異性免疫反應(yīng)隨抗體活性和純度的增加而增強(qiáng)。在酶標(biāo)記過程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價高及抗原親和力強(qiáng)的抗體球蛋白，最好使用親和層析提純的抗體，可提高敏感性，而且可稀釋使用，減少非特異性吸附。

 

酶與抗體交聯(lián)，常用戊二醛法和過碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標(biāo)記抗體的改良過碘酸鈉法簡單易行，標(biāo)記效果好，特別適用于實(shí)驗室的小批量制備。其標(biāo)記程序為:將5μg HRP溶于0.5ml蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06 mol/L的過碘酸鈉(NaIO4)水溶液0.5ml，混勻置4℃冰箱30分鐘 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30分鐘后加入含5(g純化抗體的水溶液1ml，混勻并裝透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時(或過夜)使之結(jié)合，然后吸出，加硼氫化鈉(NaBH4)溶液( 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小時，將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4℃冰箱30分鐘后離心，將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中，并對之透析過夜(4℃)，次日離心除去不溶物，即得到酶標(biāo)抗體，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，進(jìn)行測定后，冷凍干燥或低溫保存。

         

2.酶標(biāo)抗體標(biāo)記效果測定:測定內(nèi)容包括酶和抗體活性、結(jié)合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結(jié)合率。

 

(1) 酶與抗體的活性 常用瓊脂擴(kuò)散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線，經(jīng)PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，如果出現(xiàn)應(yīng)有的顏色反應(yīng)，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結(jié)合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結(jié)合物在顯色后，瓊擴(kuò)滴度應(yīng)在1:16以上。另一個測定方法是用系列稀釋的酶標(biāo)抗體直接以ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)方法進(jìn)行方陣滴定，此法不僅可以測定標(biāo)記效果，還可以確定酶標(biāo)抗體的使用濃度。

 

(2) 結(jié)合物的定量測定 一般是對結(jié)合物中的酶和IgG進(jìn)行定量測定。常用紫外分光光度計于403nm和280nm進(jìn)行測定，然后按下列公式計算:

 

酶量(mg/ml)=OD403×0.42

 

IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.4)×0.94×0.62

 

對于過碘酸鈉氧化法制備的標(biāo)記抗體量，按下列公式計算:

 

IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.34)×0.62

 

已知酶量和IgG量后，即可計算出標(biāo)記抗體的摩爾(mol)比值。

 

HRP/IgG摩爾比值=HRP(mg/ml)/IgG(mg/ml)×4

 

結(jié)合物中酶總量=HRP(mg/ml)×結(jié)合物溶液量

 

結(jié)合物產(chǎn)率=結(jié)合物中酶總量/標(biāo)記時加入的酶量×100%

 

用于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)的結(jié)合物的酶量為400(g/ml時效果一般，為500(g/ml時效果較好，達(dá) 1000(g/ml時效果最好。mol.比值由于結(jié)合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作為主要參數(shù)。一般認(rèn)為mol.比值為0.7時效果一般，1.0時效果較好，1.5-2.0時最好。酶結(jié)合率為 7%時效果一般，為9%-10%較好，達(dá)30%以上時最好。(四) ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)方法的基本類型、用途及操作程序