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蛋白樣品制備,一般裂解液包含幾個組分
閱讀:3609 發(fā)布時間:2019/5/14 9:36:21
Western Blot 又稱為蛋白質(zhì)印跡,是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的基于抗原抗體之間特異免疫反應的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。
其基本原理為:聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質(zhì)樣品分離,分離后的蛋白被轉(zhuǎn)移到固相支撐物(雜交膜)上,一抗特異性識別目標蛋白,通過HRP、AP、生物素、地高辛或者熒光探針等標記的二抗識別一抗,最終通過顯色、熒光或者化學發(fā)光等方法將目標蛋白可視化,從而對目標蛋白進行定性和定量分析。
良好的開始是成功的一半,充分裂解并保存良好的優(yōu)質(zhì)的蛋白樣品對 Western Blot 實驗至關(guān)重要。下面我們將從蛋白樣品制備的方法和試劑選擇上給大家一些建議。
裂解液的選擇
蛋白樣品制備,首先要選擇合適的裂解液。一般裂解液包含以下幾個組分:
1. 緩沖系統(tǒng):裂解液pH過高或過低都可能使蛋白質(zhì)變性析出或水解,因此通常采用近似生理pH的buffer來作緩沖體系。Tris-HCl緩沖液因其緩沖能力強,不容易與其它離子形成不溶物,且與整個電泳系統(tǒng)兼容性好,因此是裂解的首選緩沖液。
2. 鹽離子濃度:通常大家習慣以生理鹽濃度作為裂解液的鹽離子濃度。在提胞漿蛋白等易溶組分時,也有通過低鹽而實現(xiàn)低滲,從而使細胞脹破以實現(xiàn)質(zhì)膜分離的,這種情況下一般使用不超過50mM的NaCl。當鹽離子濃度過高時,部分蛋白可能會因鹽析而出現(xiàn)沉淀, 此外過高的離子濃度會導致泳道內(nèi)局部電流過大,容易跑出笑臉狀條帶。實際過程中即使有少數(shù)蛋白可能需要高鹽提取的,也會借助透析等方法除去可能產(chǎn)生干擾的鹽分,最終NaCl濃度一般不能高于500mM。
3. 變性劑:常用的變性劑有兩類,一類是以尿素或硫脲為代表的變性劑,另一類則是各種表面活性劑(俗稱去垢劑)。變性劑的作用主要是為了使蛋白變性溶解,在膜蛋白和包涵體蛋白提取時經(jīng)常會加入尿素助溶。
4. 蛋白酶、去修飾酶抑制劑:組織或細胞內(nèi)通常含有大量的蛋白酶和去修飾酶,由于細胞在裂解過程中會釋放出多種內(nèi)源性的蛋白酶、磷酸酶、去乙?;傅龋菀讓е履繕说鞍捉到饣蛉バ揎?,從而影響后續(xù)的蛋白檢測。所以在裂解時還需加入一些酶抑制劑。
常見的蛋白酶抑制劑有:PMSF、Aprotinin、Leupeptin、 Pepstatin,AEBSF-HCl等,其中PMSF對多種不同活性中心的蛋白酶都有極好的抑制作用而且效率高,因此基本是必加的試劑。
另外,做磷酸化蛋白的Western blot時,還需要加入磷酸酶抑制劑,避免磷酸化形式的蛋白發(fā)生去磷酸化。類似地,檢測乙酰化蛋白的時候還需要加入去乙?;敢种苿?。
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