由于RNA的種類來源很多,因而提取制備方法各異,一般有苯酚法,去污劑法和鹽酸胍法,其中苯酚法實(shí)驗(yàn)室最常用。組織勻漿后用苯酚處理離心,RNA即溶于上層被酚飽和的水相中,向水相加冷乙醇后, RNA即以白色絮狀沉淀析出。此法較好除去DNA和蛋白質(zhì),且獲得生物活性的RNA。
單細(xì)胞裂解液 (RNA)實(shí)驗(yàn)步驟 1. 對(duì)于單層培奍細(xì)胞
(1)每10 cm 培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細(xì)胞,用冰冷PBS洗滌3次。
(2)每次1 ml 然后用小體積PBS刮下細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至冰浴的離心管中。
(3)300 g 離心5 min,棄上清,繼續(xù)冰浴。
2. 對(duì)于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞
(1)300 g 離心5 min,棄上請(qǐng)。
(2)細(xì)胞以1/2原體積的冰冷重懸,再離心后棄上清。
3. 重懸細(xì)胞于375 μl 冰冷的細(xì)胞裂解緩沖液,并置冰浴5 min。
4. 于4℃在微量離心機(jī)中離心2 min,將上清移至一個(gè)潔凈的已加有5 μl 20%SDS的管中,立即在旋渦混合器上振蕩。
5. 加入2.5 μl 20 mg/ml 蛋白酶K,37℃溫育15 min。
6. 加入400 μl 酚/氯仿/異戊醇抽提,在旋渦混合器上振蕩用微量離心機(jī)離心,上清移至干凈的離心管中,重復(fù)抽提1遍。
7. 再以400 μl 氯仿/異戊醇抽棰,上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中。
8. 加入40 μl 3 mol/l 乙酸鈉緩沖液(pH7.5),再加無水乙醇,混勻后在干冰/乙醇中沉淀15~30 min或-20℃過夜。
9. 用微量離心機(jī)4℃離心15 min 加人1 ml 75%乙醇/25% 0.1 mol/l乙酸鈉(pH5.2)冼滌沉淀。
10. 干燥后用100 μl 處理過的水重溶沉淀,取10 μl RNA稀釋于1 ml 水中,測(cè)A280和A260,其與的RNA可在-70℃貯存。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 對(duì)于單層培奍細(xì)胞
(1)每10 cm 培養(yǎng)皿培養(yǎng)的細(xì)胞,用冰冷PBS洗滌3次。
(2)每次1 ml 然后用小體積PBS刮下細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至冰浴的離心管中。
(3)300 g 離心5 min,棄上清,繼續(xù)冰浴。
2. 對(duì)于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞
(1)300 g 離心5 min,棄上請(qǐng)。
(2)細(xì)胞以1/2原體積的冰冷重懸,再離心后棄上清。
3. 重懸細(xì)胞于375 μl 冰冷的細(xì)胞裂解緩沖液,并置冰浴5 min。
4. 于4℃在微量離心機(jī)中離心2 min,將上清移至一個(gè)潔凈的已加有5 μl 20%SDS的管中,立即在旋渦混合器上振蕩。
5. 加入2.5 μl 20 mg/ml 蛋白酶K,37℃溫育15 min。
6. 加入400 μl 酚/氯仿/異戊醇抽提,在旋渦混合器上振蕩用微量離心機(jī)離心,上清移至干凈的離心管中,重復(fù)抽提1遍。
7. 再以400 μl 氯仿/異戊醇抽棰,上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中。
8. 加入40 μl 3 mol/l 乙酸鈉緩沖液(pH7.5),再加無水乙醇,混勻后在干冰/乙醇中沉淀15~30 min或-20℃過夜。
9. 用微量離心機(jī)4℃離心15 min 加人1 ml 75%乙醇/25% 0.1 mol/l乙酸鈉(pH5.2)冼滌沉淀。
10. 干燥后用100 μl 處理過的水重溶沉淀,取10 μl RNA稀釋于1 ml 水中,測(cè)A280和A260,其與的RNA可在-70℃貯存。鈉(Na)測(cè)試盒(帶標(biāo)準(zhǔn))
氯(Cl)測(cè)試盒(帶標(biāo)準(zhǔn))
鈣(Ca)測(cè)試盒(帶標(biāo)準(zhǔn))
磷(Pi)測(cè)試盒(帶標(biāo)準(zhǔn))
谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SGPT)測(cè)試盒
谷草轉(zhuǎn)氨酶(SGOT)測(cè)試盒
總膽紅素、直接膽紅素測(cè)試盒
γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)測(cè)試盒
尿膽紅素測(cè)試盒
尿膽原測(cè)試盒
尿素氮(BUN)測(cè)試盒