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細(xì)胞懸浮培養(yǎng)幾點(diǎn)注意事項(xiàng)操作步驟

閱讀：4541     發(fā)布時(shí)間：2019/10/9 14:11:42

操作步驟
1．配制培養(yǎng)基
(1) 用于誘導(dǎo)水稻愈傷組織的培養(yǎng)基(N6)，見(jiàn)表4－1。
(2) 用于水稻懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，見(jiàn)表4－2。
按照培養(yǎng)基配方取各種藥品，zui后用蒸餾水定容到所需體積。所配制的培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后備用，固體瓊脂培養(yǎng)基分裝在250mL 的錐形瓶?jī)?nèi)，每瓶約分裝30mL。
2．水稻種子的消毒
（1）將種子置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，以體積分?jǐn)?shù)95％的酒精消毒1～2min。
（2）取出后用無(wú)菌水沖洗2～3 遍。
（3）將種子放入25.0g/L 的次氯酸鈉溶液中輕輕搖動(dòng)后，浸泡60min 。
（4）取出后用無(wú)菌水沖洗，將次氯酸鈉溶液充分洗凈。
3．懸浮培養(yǎng)的開(kāi)始：
當(dāng)?shù)玫接鷤M織后，將其轉(zhuǎn)人到AA 液體培養(yǎng)基中。注意愈傷組織塊應(yīng)小于3mm . 若組織塊較大可用無(wú)菌解剖刀將其分割成小塊。液體培養(yǎng)基分裝在250mL 的錐形瓶?jī)?nèi)．接種完畢后將瓶口用封口膜封好，把培養(yǎng)瓶放到恒溫?fù)u床上進(jìn)行震蕩培養(yǎng)。調(diào)整搖床的旋轉(zhuǎn)速度，使之為120r/min。培養(yǎng)溫度為26℃，在黑暗中培養(yǎng)。
4. 接種
在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將滅菌后的水稻種子接到誘導(dǎo)愈傷組織的固體培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶接5～10 粒種子。接種完畢后用封口膜將培養(yǎng)瓶封好，放在26℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。
表4－1 用于誘導(dǎo)水稻愈傷組織的培養(yǎng)基
 
表4－2 用于水稻懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基
植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
5．懸浮培養(yǎng)物的保持
進(jìn)行懸浮培養(yǎng)后要不斷進(jìn)行觀察，由于培養(yǎng)物的繼代培養(yǎng)與培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)物的密度及細(xì)胞生長(zhǎng)速度有關(guān)，因此當(dāng)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)物密度較大時(shí)，應(yīng)及時(shí)用無(wú)菌的吸管吸取部分培養(yǎng)物到一新的50mL 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)還要及時(shí)淘汰一些大的組織團(tuán)塊和黃褐色的壞死組織。一般每隔4～7d 就要繼代一次。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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