酶免疫技術(shù)——酶和酶作用的底物

閱讀：640     發(fā)布時間：2019/9/18 16:16:58

 酶免疫技術(shù)是利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用，提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)檢測敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。該技術(shù)所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專一性強、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、價格不貴、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。zui好在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定，光吸收高。

 

 

酶和酶作用的底物

 

 

    1.辣根過氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復(fù)雜。它是一種糖蛋白，含糖量約18%；分子量為44kD；是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無色糖蛋白，在275nm波長處有zui高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP對受氫體的專一性很高，除H202外，僅作用于小分子醇的過氧化物和尿素的過氧化物。后者為固體，作為試劑較H202方便。

 

 

    許多化合物可作為HRP的供氧體，在ELISA中常用的供氫體底物為鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和ABTS.OPD為在ELISA中應(yīng)用zui多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差，而且具有致異變性。TMB無此缺點。TMB經(jīng)酶作用后由無色變藍色，目測對比鮮明；加酸停止酶反應(yīng)后變黃色，可在比色計中定量；因此應(yīng)用日見增多。ABTS，雖然靈敏度不如0PD和TMB，但空白值很低。

 

 

    2.堿性磷酸酶（AP）：是從牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。從大腸桿菌提取的AP分子量為80kD，酶作用的zui適pH為8.0；用小牛腸黏膜提取的AP分子量為l00kD，zui適pH為9.6.一般采用對**苯***（p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對**酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時間。

 

 

    在ELISA中應(yīng)用AP系統(tǒng)，其敏感性一般高于應(yīng)用HRP系統(tǒng)，空白值也較低。但由于AP較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較HRP低，價格較HRP高，制備酶結(jié)合物時得率較HRP低等原因，國內(nèi)在ELISA中一般均采用HRP.3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-半乳糖苷，經(jīng)酶水解后產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘酮，可用熒光計檢測。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可應(yīng)用可產(chǎn)生熒光的傘基***作底物。其缺點是需要熒光計測定，而且如用固相載體直接作為測定容器，此載體不可發(fā)出熒光。脲酶的特點是酶作用后反應(yīng)液發(fā)生pH改變，可使指示劑變色；另外，在人體內(nèi)沒有內(nèi)源酶。