1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅
b.單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。
c．細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。
His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。9. 接下來，使用75%乙醇洗滌RNA沉淀，以去除殘留的異丙醇和鹽類。向含有RNA沉淀的離心管中加入至少1ml的75%乙醇（用無RNA酶水配制），輕輕顛倒離心管數(shù)次以洗滌RNA沉淀，避免劇烈振蕩導(dǎo)致RNA碎裂。
10. 再次進(jìn)行離心，條件為2-8℃下10000×g離心5分鐘。離心后，小心移除乙醇，注意不要吸走RNA沉淀？啥虝嚎諝飧稍颮NA沉淀，但需注意避免過度干燥，以免RNA難以溶解。
11. 使用適量的無RNA酶水（通常為20-50μl，根據(jù)RNA沉淀量調(diào)整）溶解RNA沉淀。輕輕吹打或用移液器輕輕吸打幾次，幫助RNA完全溶解。將溶解后的RNA溶液置于冰上，或立即進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，如反轉(zhuǎn)錄或RNA質(zhì)量檢測。
12. RNA質(zhì)量驗(yàn)證：可通過電泳觀察RNA條帶（28S、18S和5S）的完整性，以及使用分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度（A260/A280比值應(yīng)接近2.0）。高質(zhì)量的RNA是進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。
13. 若需進(jìn)一步純化或使用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行蛋白純化，請按照試劑盒的詳細(xì)說明書進(jìn)行，注意操作過程中的還原劑和螯合劑耐受性要求，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
14. 最后，請妥善保存RNA和純化后的蛋白樣品，避免反復(fù)凍融，以保證其穩(wěn)定性和活性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠的材料支持。
原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司
13585831301
021-59541103 021-60443211
3004967995
![人胚腎細(xì)胞；293 [HEK-293]](http://img5.zhihuilv.com/223/Products/Small/20190314/201903141023106619.jpg)
關(guān)于莼試
產(chǎn)品訂購
新手指南
幫助中心