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Elisa試劑盒常用方法與常見問(wèn)題有哪些？

閱讀：967     發(fā)布時(shí)間：2019/1/14 13:49:57

Elisa試劑盒常用方法與常見問(wèn)題有哪些？ELISA原理及類型ELISA是一種廣泛應(yīng)用在測(cè)定液體樣本中的蛋白、抗體、或激素的免疫分析技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)程序，通常是把蛋白、抗體、或激素等（即抗原）直接或是以捕捉抗體（capture Ab）固定在固相載體上，再加入一級(jí)檢測(cè)抗體（primarydetection Ab），形成一個(gè)抗原抗體的復(fù)合物。如果該抗體已經(jīng)用酶（enzyme）標(biāo)記了，即可用來(lái)直接測(cè)定抗原的量，若無(wú)，則可利用另一個(gè)酶標(biāo)記的二級(jí)抗體來(lái)測(cè)定抗原的量。測(cè)定抗原量的方法是加入該酶的底質(zhì)（substrate），作用后產(chǎn)生出現(xiàn)的顏色深淺和樣本中的抗原量呈正比的關(guān)系，依此原理計(jì)算出樣本中的抗原總量或濃度。1.直接法（direct ELISA）將抗原直接固定在固相載體上，加入酶標(biāo)記的一級(jí)抗體，即可測(cè)定抗原總量，此一級(jí)抗體的特異性非常重要。優(yōu)勢(shì)：操作手續(xù)簡(jiǎn)短，因無(wú)須使用二抗可避免交互反應(yīng)。缺點(diǎn)：試驗(yàn)中的一抗都得用酶標(biāo)記，但不是每種抗體都適合做標(biāo)記，費(fèi)用相對(duì)提高。2.間接法（indirect ELISA）此測(cè)定方法與直接法類似，差別在于一級(jí)抗體沒有酶標(biāo)記，改用酶標(biāo)記的二級(jí)抗體去辨識(shí)一級(jí)抗體來(lái)測(cè)定抗原量。優(yōu)勢(shì)：二抗可以加強(qiáng)信號(hào)，而且有多種選擇能做不同的測(cè)定分析。不加酶標(biāo)記的一級(jí)抗體則能保留它最多的免疫反應(yīng)性。缺點(diǎn)：交互反應(yīng)發(fā)生的機(jī)率較高。3.雙抗體夾心法（sandwich ELISA）被檢測(cè)的抗原包被在兩個(gè)抗體之間，其中一個(gè)抗體將抗原固定于固相載體上，即捕捉抗體。另一個(gè)則是檢測(cè)抗體，此抗體可用酶標(biāo)記后直接測(cè)定抗原的量；或不標(biāo)記，再透過(guò)酶標(biāo)記的二級(jí)抗體來(lái)測(cè)定抗原的量。這兩種抗體必須小心選取，才可避免交互反應(yīng)或競(jìng)爭(zhēng)相同的抗原結(jié)合部位。優(yōu)勢(shì)：高靈敏、高專一性，抗原無(wú)須事先純化。缺點(diǎn)：抗原一定得擁有兩個(gè)以上的抗體結(jié)合部位。4.競(jìng)爭(zhēng)法（competitive ELISA）樣本里的抗原（自由抗原）和純化并固定在固相載體上的抗原（固定抗原）一起競(jìng)爭(zhēng)相同的抗體，當(dāng)樣品里的自由抗原越多，就可以結(jié)合越多的抗體，而固定抗原就只能結(jié)合到較少的抗體，反之亦然。經(jīng)清洗步驟，洗去自由抗原和抗體的復(fù)合物，只留下固定抗原和抗體的復(fù)合物，拿來(lái)與只有固定抗原的對(duì)照組結(jié)果相比較，根據(jù)呈色差異就可計(jì)算出樣品里的抗原含量。優(yōu)勢(shì)：可適用比較不純的樣本，而且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性很高。缺點(diǎn)：整體的敏感性和專一性都較差。5.最新ELISA技術(shù)基于細(xì)胞法（cell-based ELISA）：是一種新的定性蛋白檢測(cè)技術(shù)，將細(xì)胞直接在微孔板里培養(yǎng)，待檢測(cè)時(shí)，不需抽提蛋白和裂解細(xì)胞，便可直接測(cè)量微孔板里蛋白經(jīng)刺激或抑制作用后的變化。優(yōu)勢(shì)：無(wú)需裂解細(xì)胞，所以目標(biāo)蛋白損失最少，可測(cè)定完整細(xì)胞、黏附細(xì)胞、還有非粘附細(xì)胞。缺點(diǎn)：不能測(cè)定抗原量。ELISA實(shí)驗(yàn)中可能影響結(jié)果的原因及解決方法樣品收集和保存用于ELISA測(cè)定最常用的臨床標(biāo)本是血清（漿）。要注意避免嚴(yán)重溶血，因?yàn)檠t蛋白中含有具有類似過(guò)氧化物活性的血紅素基團(tuán)，在孵育時(shí)很容易吸附于固相，與HRP底物反應(yīng)產(chǎn)生假陽(yáng)性。樣品采集及血清分離中要注意避免細(xì)菌污染，一方面細(xì)菌分泌的酶可能對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用，另一方面，細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶會(huì)對(duì)相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。樣品應(yīng)該要避免反復(fù)凍融。因反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。另外，樣品混勻時(shí)，不要?jiǎng)×艺袷帲磸?fù)顛倒混勻即可。一般而言，如果在收集樣品的當(dāng)天進(jìn)行檢測(cè)，可將樣品及時(shí)儲(chǔ)存在4℃?zhèn)溆；而?duì)隔天再檢測(cè)的樣本，應(yīng)及時(shí)分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆茫粢L(zhǎng)期保存樣品，最好將其置于-70℃凍存。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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